Евгений Евстигнеев родился 9 октября 1926 года в Нижнем Новгороде. Детство Евгения прошло на окраине, которая называлась посёлком Володарского.
Его отец был на двадцать лет старше матери. Оба они были рабочими: Александр Михайлович — металлист, Мария Ивановна — фрезеровщица. Для своей матери — Марии Ивановны — он был поздним ребёнком: когда он появился на свет, ей было 32 года. Женя рано, шести лет, остался без отца, мама второй раз вышла замуж, но и отчим умер, когда мальчику было семнадцать. До войны Женя успел окончить семилетку и в 1941 году пошёл работать электромонтёром. Потом год проучился в дизелестроительном техникуме, но после смерти отчима пришлось идти зарабатывать.
В 1943-1947 годах работал слесарем на заводе «Красная Этна» в Горьком.
В 1951 году окончил Горьковское театральное училище и до 1954 года был актёром Владимирского областного драматического театра. 
В 1956 году окончил Школу-студию имени В.И. Немировича-Данченко при МХАТ и стал актёром этого театра.
В 1957-1970 годах — артист театра «Современник».
С 1970 года — артист МХАТа.
Сниматься в кино начал ещё в 1957 году (первый фильм «Поединок»), преимущественно в небольших ролях. Позже на счёту актёра было уже около двух десятков главных ролей. Всего снялся более чем в ста лентах в кино и на телевидении.
Актёр был трижды женат. Первая супруга — актриса, а затем художественный руководитель театра «Современник» Галина Борисовна Волчек. 29 октября 1961 года у них родился сын Денис, ставший в будущем известным кинорежиссёром и оператором.
Вторая жена — актриса Лилия Журкина (1937-1986). В этом браке 13 мая 1968 года появилась на свет дочь Маша, ставшая впоследствии, как и её родители, артисткой театра и кино.
Третья супруга — молодая актриса и его ученица Ирина Цывина (поженились в 1989 году).
1 марта 1992 года — актёр в последний раз вышел на сцену театра в роли карточного шулера Глова в спектакле «Игроки ХХІ» (постановка Сергея Юрского).
2 марта 1992 года — актёр вместе с женой Ириной вылетел в Англию, где ему должны были сделать операцию на сердце.
Евгений Евстигнеев скончался 4 марта 1992 года на 66-м году жизни в одной из клиник Лондона накануне операции. Похоронен актёр в Москве на Новодевичьем кладбище, участок № 10, ряд № 6, место № 18.
Нижегородское театральное училище носит имя Е.А. Евстигнеева. Во Владимирской области учреждена театральная премия имени Е.А. Евстигнеева. В Нижнем Новгороде возле Нижегородского академического театра драмы установлена скульптура Е.А. Евстигнеева. 9 октября 2014 года установлена мемориальная доска на улице Бакунина в Канавинском районе Нижнего Новгорода, где актёр прожил первые 8 лет жизни.
Заслуженный артист РСФСР (21.02.1968).
Народный артист РСФСР (30.05.1974).
Народный артист СССР (23.02.1983).
Всё исполненные им роли хороши, но мне запомнились наиболее «Бег» — коммерсант Парамоша, «Зимний вечер в Гаграх», «Собачье сердце» — профессор Преображенский.
Фильмография:
1957 — Поединок — Петерсон
1958 — Васисуалий Лоханкин (к/м) — Васисуалий Лоханкин
1959 — Баллада о солдате — водитель грузовика
1960 — Анюта — художник
1961 — В трудный час — сосед Ольги
1961 — Любушка — Филипп
1961 — Человек идёт за солнцем — Николай Черных, мотоциклист
1962 — Девять дней одного года — Николай Иванович
1962 — Никогда — Александр Иванович Алексин
1962 — Молодо-зелено — Жохов, священник
1963 — Им покоряется небо — Иван Сергеевич
1963 — Сотрудник ЧК — Марков
1964 — Добро пожаловать, или Посторонним вход воспрещён — Дынин, начальник пионерского лагеря
1964 — Хотите — верьте, хотите — нет… — сосед-профессор
1965 — Верьте мне, люди — Костиков
1965 — Верность — Иван Терентьевич
1965 — Знойный июль — следователь
1965 — Гиперболоид инженера Гарина — инженер Пётр Петрович Гарин
1966 — Скверный анекдот — Пралинский
1966 — Строится мост — Синайский
1966 — Старшая сестра — Огородников
1966 — Всадник над городом — Дядя Владя
1966 — Берегись автомобиля — режиссёр народного театра
1966 — Крылья — Миша
1966 — Мангышлак. Начало пути. — голос за кадром
1967 — Они живут рядом — Данилов
1967 — Стюардесса (к/м) — пьяный пассажир
1967 — Штрихи к портрету В. И. Ленина — Анатолий Луначарский
1968 — Золотой телёнок — Александр Иванович Корейко, подпольный миллионер
1968 — Всего одна жизнь — Чичерин
1969 — Зигзаг удачи — Калачёв
1969 — Это было в разведке — фотограф
1969 — Старый дом — Яковлев
1969 — Мосты через забвение — человек с гвоздями
1969 — Странные люди (серия «Братка») — старший брат
1969 — Обвиняются в убийстве — Спиридонов
1969 — Чайковский — Герман Ларош
1970 — Бег — Парамон Ильич Корзухин
1970 — Свой — Георгий Ефимович
1971 — Старики-разбойники — Валентин Петрович Воробьёв
1971 — Вся королевская рать — Ларсон
1971 — Достояние республики — Витоль
1972 — Вечер воспоминаний («Фитиль») — пьяница
1972 — Жертва гостеприимства («Фитиль») — пьяница Дед Мороз
1972 — Командир счастливой «Щуки» — Степан Лукич
1972 — Ход белой королевы — Дрыжик
1972 — Приваловские миллионы — Иван Яковлевич
1972 — Учитель пения — инспектор жилконторы
1973 — Семнадцать мгновений весны — Вернер Плейшнер, профессор
1973 — Невероятные приключения итальянцев в России — хромой
1973 — Старая крепость — Петлюра
1973 — Дача — Фёдор — художник
1974 — Жребий — Профессор
1974 — Нейлон 100 % — Стоматолог
1974 — Моя судьба — Тимофей Кожухов / Павел Тимофеевич Кожухов
1974 — Последнее лето детства — Валентин Валентинович Навроцкий, расхититель мануфактуры
1974 — Ещё можно успеть — Сеглин
1975 — На ясный огонь — Пирамидов
1975 — Потрясающий Берендеев — отец Берендеева
1975 — Вкус халвы — Визирь
1975 — Гамлет Щигровского уезда — Фёдор Михеич
1975 — Вариант «Омега» — Симаков
1976 — Без дураков («Фитиль») — чиновник
1976 — Легенда о Тиле — священник
1976 — Дни хирурга Мишкина — Филипп Иванович
1976 — Жизнь и смерть Фердинанда Люса — Дигон
1976 — Повесть о неизвестном актёре — Пал Палыч Горяев
1977 — Про Красную Шапочку — Звездочёт
1977 — Подранки — Сторож
1977 — Нос — чиновник газетной экспедиции
1977 — Переезд — Дядя Федя — работник технической службы железной дороги
1977 — По семейным обстоятельствам — Николай
1978 — Кровь и пот — Чернов, генерал
1979 — С любимыми не расставайтесь — Хомак
1979 — Примите телеграмму в долг — отец Сашеньки
1979 — Место встречи изменить нельзя — Пётр Ручников по кличке «Ручечник»
1980 — Чёрная курица, или Подземные жители — Батюшка
1980 — Старый Новый год — Иван Адамыч
1980 — Атланты и кариатиды — Сосновский
1981 — Рождённые бурей — Хейзе, полковник
1981 — Любимая женщина механика Гаврилова — дядя Риты
1982 — Не хочу быть взрослым — Актёр
1983 — Демидовы — Никита Демидович Антуфьев
1983 — Комический любовник, или Любовные затеи сэра Джона Фальстафа — Герцог
1983 — Мы из джаза — «Папа», вор-карманник
1984 — Ещё люблю, ещё надеюсь — Василий Васильевич
1984 — Сказки старого волшебника — новый король
1984 — Предел возможного — Куликов, профессор
1984 — Перикола — Вице-король
1984 — И жизнь, и слёзы, и любовь — Степан Степанович (Стаканыч)
1984 — Прохиндиада, или Бег на месте — зритель в зале
1985 — Человек с аккордеоном — Лопатин
1985 — Зимний вечер в Гаграх — Алексей Иванович Беглов
1987 — Моонзунд — фон Эссен, адмирал
1987 — Гардемарины, вперёд! — Алексей Петрович Бестужев, вице-канцлер
1987 — Следопыт — Сахем племени сенеков
1987 — Джек Восьмёркин — «американец» — Кацауров, адмирал
1987 — Она с метлой, он в чёрной шляпе — Ворон (озвучка)
1988 — Город Зеро — хранитель музея
1988 — Собачье сердце — профессор Преображенский
1988 — Новые приключения янки при дворе короля Артура — Архиепископ
1988 — Ёлки-палки! — Юрий Викторович
1989 — Пиры Валтасара, или Ночь со Сталиным — Михаил Иванович Калинин
1989 — Биндюжник и Король — Никифор, кучер
1989 — Канувшее время — Василий Данилович Челышев, академик
1990 — Яма — председатель суда
1990 — Шапка — Константин Баранов, писатель
1990 — Десять лет без права переписки — Исай Львович, профессор
1990 — Сукины дети — Андрей Иванович Нанайцев
1990 — …По прозвищу «Зверь» — старый зэк
1991 — Виват, гардемарины! — Бестужев
1991 — Ночные забавы — Александр Григорьевич Андрющенко, саксофонист
1991 — Глас вопиющий — палач
1992 — Гардемарины III — Бестужев
1992 — Как живёте, караси? — Анатолий, диссидент, карась-эмигрант
1992 — Сны о России — придворный садовник
1992 — Арбитр — голос за кадром
1992 — Лавка «Рубинчик» и… — Профессор
1996 — Ермак — Иван Грозный (фильм закончен после смерти актёра, роль озвучена Сергеем Арцибашевым)
Телеспектакли:
1972 — На дне — Сатин
1977 — Заседание парткома — Лев Алексеевич Соломахин
1978 — Мораль пани Дульской — Пан Дульский
1981 — Этот фантастический мир. Выпуск № 6 — Кеннет Берг
1983 — В городе хорошая погода — секретарь райкома партии
1983 — Человек из страны Грин — Франк Давенант
1984 — Три сестры — Чебутыкин
1987 — Игра в детектив — инспектор полиции
1992 — Вишнёвый сад — Фирс
Озвучивание мультфильмов:
1972 — Весёлые ребята
1977 — Бравый инспектор Мамочкин
1978 — Как Тоску одолели
1985 — Чертёнок с пушистым хвостом
1986 — Маленькая колдунья (Чехословакия) — Ворон (дубляж)
